Spektrofotometre er blevet rutinemæssige instrumenter i moderne molekylærbiologilaboratorier. Anvendes ofte til nukleinsyre, proteinkvantificering og kvantificering af bakterievækstkoncentrationer.
Enkelt princip om spektrofotometer
Spektrofotometret bruger en lyskilde, der kan generere flere bølgelængder, og passerer gennem en række spektroskopiske enheder til at generere en lyskilde med en bestemt bølgelængde. Efter at lyskilden passerer gennem prøven, der skal testes, absorberes en del af lyskilden, og absorbans af prøven beregnes, hvorved der omdannes til en prøvekoncentration. . Prøvenes absorbans er proportional med koncentrationen af prøven.
Kvantificering af nukleinsyrer
Kvantificering af nukleinsyrer er den hyppigst anvendte funktion af spektrofotometret. Oligonukleotider, enkeltstrenget, dobbeltstrenget DNA og RNA kan kvantificeres i en buffer. Absorptionstoppen for den højeste absorptionsspids for nukleinsyre er 260 nm. Den molekylære sammensætning af hver nukleinsyre er forskellig, så konverteringsfaktorerne er forskellige. For at kvantificere forskellige typer nukleinsyrer skal du vælge de tilsvarende koefficienter på forhånd. F.eks. Svarer absorbansen af 1 OD til 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNA og 30 μg / ml Olig. Absorbansen efter testen omdannes af de ovennævnte koefficienter for at opnå den tilsvarende prøvekoncentration. Før testning skal du vælge den korrekte procedure, indtaste volumen af stamopløsningen og fortyndingsmidlet og derefter teste emnet og prøveopløsningen. Imidlertid var eksperimentet ikke altid glat. Ustabil aflæsning kan være den største hovedpine for eksperimentatoren. Instrumenter med højere følsomhed viser større drift i absorbans.
Faktisk tillader spektrofotometerets designprincip og arbejdsprincip at absorbansen kan variere inden for et bestemt interval, dvs. instrumentet har en vis nøjagtighed og præcision. For eksempel er nøjagtigheden af Eppendorf Biophotometer ≤1,0% (1A). Resultaterne af sådanne multiple tests varierer mellem ca. 1,0% af middelværdien og er normale. Derudover er det også nødvendigt at overveje de fysisk-kemiske egenskaber af selve nukleinsyren og pH-værdien i den puffer, hvori nukleinsyren er opløst, ionkoncentrationen osv.: Når ionkoncentrationen er for høj under testen, læse skift, så det anbefales at bruge en bestemt pH-værdi og en lav ionkoncentration. Buffere, såsom TE, stabiliserer i høj grad aflæsningerne. Prøvens fortyndingskoncentration er også en faktor, der ikke kan ignoreres: på grund af den uundgåelige tilstedeværelse af nogle fine partikler, især nukleinsyreprøver, i prøven. Tilstedeværelsen af disse små partikler forstyrrer testresultaterne. For at minimere partiklenes virkning på testresultaterne kræves det, at nukleinsyrens absorbans er mindst større end 0,1 A, og absorbansen er fortrinsvis mellem 0,1 og 1,5 A. Inden for dette interval er interferensen af partikler er relativt små, og resultatet er stabilt.
Dette betyder, at koncentrationen af prøven ikke bør være for lav eller for høj (ud over fotometerets testområde). Endelig skal driftsfaktorerne, såsom blanding, være tilstrækkelige, ellers er absorbansværdien for lav, endog negative værdier; blandingen kan ikke eksistere bobler, den tomme væske har ingen suspenderet stof, ellers drifter aflæsningen drastisk; den samme kuvette skal bruges til at teste emnet og prøven. Ellers er forskellen i koncentration for stor; konverteringsfaktoren og prøvekoncentrationsenheden vælges konsekvent; kuvetten med vinduesslitage kan ikke bruges; prøveens volumen skal nå det mindste volumen, der kræves af kyvetten.
Ud over nukleinsyre-koncentrationen viser spektrofotometeret også adskillige meget vigtige forhold, der indikerer prøvens renhed, såsom forholdet mellem A 260 / A 280, der bruges til at vurdere prøvens renhed, fordi proteinets absorptionsspids er 280 nm. En ren prøve med et forhold større end 1,8 (DNA) eller 2,0 (RNA). Hvis forholdet er lavere end 1,8 eller 2,0, indikerer det tilstedeværelsen af proteiner eller fenoliske stoffer. En 230 indikerer, at nogle kontaminanter er til stede i prøven, såsom kulhydrater, peptider, fenoler osv., Og forholdet mellem den renere nukleinsyre A 260 / A 230 er større end 2,0. En 320 detekterer opløsningen og andre interferensfaktorers turbiditet. For rene prøver er A 320 generelt 0.
Hangzhou Sumer Instrument Co., Ltd
Tilføj: No.168 Wuchang Ave., Yuhang District, Hangzhou 310023, Kina
TEL: + 86-571-88739859
Telefon: +8618658504900
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com