Spektrofotometrisk kolorimetrisk proteinkvantificering
Proteiner er som regel en blanding af proteiner. Colorimetriske analyser er baseret på proteinkomponenter: Aminosyrer (fx tyrosin, serin) reagerer med en yderligere kromogen gruppe eller farvestof for at fremstille et farvet materiale. Koncentrationen af det farvede materiale er direkte relateret til antallet af aminosyrer, proteinet reagerer og derved afspejler proteinkoncentrationen.
Colorimetrisk metode
Der er flere metoder som BCA, Bradford og Lowry.
Lowry-metoden: Baseret på den tidligste Biuret-reaktion og forbedret. Proteinet reagerer med Cu2 for at frembringe en blå reaktion. Lowry-metoden er dog mere følsom end Biuret. Ulempen er behovet for sekventielt at tilføje flere forskellige reagenser; reaktionen tager lang tid; er modtagelig for ikke-proteinstoffer; proteiner indeholdende EDTA, Triton x-100 og ammoniak sulfat er ikke egnede til denne fremgangsmåde.
Bicinchoniininsyreanalyse: Dette er et nyere, mere følsomt proteinassay. Proteinet, som skal analyseres, reagerer med Cu2 i en alkalisk opløsning for at fremstille Cu, som danner et chelat med BCA til dannelse af en lilla forbindelse med en absorptionsspids ved 562 nm. Det lineære forhold mellem koncentrationen af denne forbindelse og proteinet er stærk, og forbindelsen dannet efter reaktionen er meget stabil. I forhold til Lowry-metoden er operationen enkel, og følsomheden er høj. Ligesom Lowry-metoden er den imidlertid modtagelig for indblanding i proteiner og vaskemidler.
Bradford-metoden: Princippet med denne metode er, at proteinet reagerer med Coomassie Brilliant Blue for at frembringe en farvet forbindelse, der absorberer ved 595 nm. Den største funktion er dens følsomhed, hvilket er 2 gange så lavt som Lowry og BCA. Det er enklere og hurtigere. Det kræver kun en slags reaktionsreagens. Forbindelsen kan være stabil i 1 time for at lette resultatet; Forstyrrer Lowry, reagerer BCA med reduktionsmidler (f.eks. DTT, mercaptoethanol) kompatibelt. Det er dog stadig følsomt over for vaskemidler. Den største ulempe er, at forskellige standarder kan medføre store forskelle i resultaterne af den samme prøve og ikke sammenlignelige resultater.
Nogle forskere, der udsættes for kolorimetriske målinger for første gang, kan forveksles med resultaterne af de forskellige kolorimetriske test. Hvilke slags metoder tror du på at være forvirret? På grund af det faktum, at grupperne reagerede på forskellige måder, og de kromogene grupper ikke er ens, anvendes flere metoder samtidigt for at gøre prøvekoncentrationerne af den samme prøve inkonsekvent. For eksempel beskriver Keller et al. testet proteinet i modermælk og fandt ud af, at koncentrationerne målt af Lowry og BCA var signifikant højere end Bradfords koncentration. Forskellen var signifikant. Selv hvis den samme prøve bestemmes, er standardprøven valgt med den samme kolorimetriske metode inkonsekvent, og koncentrationen efter testen er også inkonsekvent. Brug f.eks. Lowry til at teste proteinet i cellehomogenatet ved anvendelse af BSA som standard med en koncentration på 1,34 mg / ml og en globulin som standard med en koncentration på 2,64 mg / ml. Derfor foretrækkes det, inden man vælger en kolorimetrisk metode, at henvise til den kemiske sammensætning af prøven, der skal testes, og finde et kemisk lignende standardprotein som en standard. Derudover forårsager den kolorimetriske metode til kvantificering af proteiner ofte problemer ved at absorbansværdien af prøven er for lav, hvilket resulterer i en stor forskel mellem den målte prøvekoncentration og den faktiske koncentration. Hovedproblemet er, at farven på den vigtige del af 1011 spektrofotometeret, kyvetten, har en vis halveringstid, så hver kolorimetriske metode viser reaktionstidspunktet. Alle prøver (inklusive standardprøver) skal testes indenfor denne tid. Hvis tiden er for lang, bliver den opnåede absorbansværdi mindre, og den konverterede koncentrationsværdi falder. Herudover er reaktionstemperaturen, opløsningens pH-værdi osv. Alle vigtige faktorer, som påvirker eksperimentet. Derudover er det meget vigtigt at anvende plastikfarimetri. Undgå at bruge kuvetter fremstillet af kvarts eller glas, fordi farven efter reaktion vil medføre, at kvarts eller glas bliver farvet, hvilket resulterer i en unøjagtig absorbans af prøven.
Virksomheden har specialiseret sig i salg af spektrofotometre , velkomne kunder, der har behov for at høre og købe, vi vil give dig oprigtige service- og kvalitetsprodukter samt lavere priser.
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com